摘要：目的运用Plackett-Burman实验设计联用星点设计-响应面法（CCD-RSM）筛选超声-微波协同提取大青叶中靛玉红的提取工艺。方法运用Plackett-Burman实验设计筛选主要影响因素，采用CCD-RSM优选靛玉红的提取工艺。以乙醇体积分数、料液比、提取时间为自变量，靛玉红提取量为因变量，通过对自变量与因变量的完全2次响应曲面的回归拟合，利用三维曲面图直观分析大青叶中靛玉红提取 工艺，并进行预测分析。结果靛玉红的 提取工艺为乙醇体积分数为62%，液料比为26，提取时间为9min。在此 条件下，大青叶中靛玉红提取量的 估计值为4.37mg/g，实验结果与模型预测值相符。结论利用Plackett-Burman实验设计联用CCD-RSM确定了大青叶中靛玉红的提取工艺，该方法简便，精度更高、重现性好、预测性强。
大青叶IsatidisFolium为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort.的干燥叶。其味苦，性寒，归心、胃经，具有清热解*、凉血消斑功效，临床用于温病高热、神昏、发斑发疹、痄腮、喉痹、丹*、痈肿等证的治疗[1]。大青叶为临床常用清热解*中药，应用广泛，疗效确切，含有靛玉红、靛蓝、有机酸、苷类及甾醇类等药效物质[2]。现代药理学研究表明，大青叶中含有的靛玉红具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗病*、抗菌、抗肿瘤等作用[3-7]。
目前，对于大青叶中靛玉红的提取工艺优化多采用正交试验设计法，而采用Plackett-Burman设计筛选关键因素及星点设计-响应面法（CCD-RSM）优化提取工艺的报道较少。Plackett-Burman实验设计联用CCD-RSM采用非线性数学模型拟合，较常用的正交试验设计实验精度高、预测性好、可信度高[8-12]。选用超声-微波协同萃取相对于传统方法可缩短提取时间、提高提取效率、降低能耗[13]。本实验以大青叶为原料，采用Plackett-Burman设计法筛选影响大青叶提取液中靛玉红提取量的主要因素，并通过CCD-RSM优化提取工艺，确定较优的提取工艺条件，为大批量生产提供参考依据。
1仪器与试药
1.1仪器
LC-AHT高效液相色谱仪，日本岛津公司；CW-型超声-微波协同萃取仪，上海新拓微波溶样测试技术有限公司，微波功率0～W连续可调，超声功率50W；FAN电子天平，上海精密科学仪器有限公司。
1.2药材与试剂
对照品靛玉红，中国食品药品检定研究院，批号-，质量分数≥98.5%；大青叶药材，安徽亳州市双华中药饮片厂，经宁波立华制药有限公司总工程师周海滨鉴定为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort.的干燥叶；娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；色谱 ，天津四友试剂厂；95%乙醇，沈阳市华东试剂厂。
2方法与结果
2.1大青叶中靛玉红的提取
选取经过鉴定的大青叶样品，挑选、洗净、50℃干燥、粉碎，过四号筛，备用。
2.2靛玉红含量测定
2.2.1色谱条件色谱柱为KromasilC18柱（mm×4.6mm，5μm）；柱温25℃；流动相为 -水（75∶25）；体积流量为1mL/min；检测波长nm；进样量20μL；理论塔板数按靛玉红峰计算应不低于[1]。
2.2.2对照品溶液的制备取靛玉红对照品适量，精密称定，加 制成含2μg/mL的溶液，即得靛玉红对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛） g，精密称定，置mL锥形瓶中，按照Plackett-Burman试验和CCD-RSM试验加入一定量试剂，放入超声-微波协同萃取仪中加热。放冷，抽滤后，滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.2.4线性关系考察分别取“2.1.2”项下对照品溶液，加 稀释制成质量浓度为0.50、1.00、2.00、4.00、8.00μg/mL的对照品溶液，摇匀。在选定的色谱条件下分别进样20μL，记录各色谱峰峰面积，以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程为Y＝X－，r＝0.，表明靛玉红进样量在0.01～0.16μg具有良好的线性关系。
2.3Plackett-Burman实验优化
2.3.1Plackett-Burman实验设计Plackett-Burman设计法是一种经济而有效的2水平实验方法，可以通过较少的实验快速地从众多影响因素中筛选出显著影响因素[14]。实验过程中对微波功率（x1）、提取次数（x2）、液料比（x3）、粒径（x4）、提取时间（x5）、超声功率（x6）、乙醇体积分数（x7）、溶剂类型（x8）8个因素分别编码，并设置1个常量（x9）。每个因素设置2个水平，高水平赋值为+1，低水平赋值为?1，以大青叶提取液中靛玉红提取量（Y，提取液中靛玉红质量/药材质量）为响应值，采用Minitab软件进行实验设计，共12组实验，因素水平编码、实验设计与结果见表1。
2.3.2Plackett-Burman设计数据分析应用Minitab软件对表1中的数据进行逐步回归分析，以Y作为响应值的 方程为Y＝3.＋0.x1－0.x2－0.x3－0.x4－0.x5－0.x6＋1.x7－0.x8，r＝0.，结果表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，其校正决定系数（radj）为0.，表明此模型能解释98.31%效应值变化，因此该模型拟合程度良好。对上述回归模型进行显著性检验，结果见表2、3和图1。由表2、3可知，F检验（P＝0.）说明回归在统计学上是显著的，即该模型在被研究的整个回归区域拟合较好。影响大青叶提取液中靛玉红提取量的主要因素为乙醇体积分数、提取次数、提取时间、溶剂类型。标准化效应的正态图表明，乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数对大青叶提取液中靛玉红提取量的影响极显著。综合分析，影响靛玉红提取量的主要因素为乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数。
2.4CCD-RSM实验优化
2.4.1CCD-RSM实验设计在Plackett-Burman实验的基础上，根据星点设计原理，以靛玉红含量为响应值，在固定微波功率W、超声功率50W、提取2次、药材粒径以通过三号筛为准的前提下，选择乙醇体积分数（X1）、液料比（X2）和提取时间（X3）3个因素为自变量，每个因素确定5个水平，共20个试验点（6个中心点），以靛玉红提取量作因变量考察指标，采用CCD-RSM分析以寻求 工艺参数，因素水平编码、试验安排和结果见表4。
2.4.2CCD-RSM数据分析应用Design-Expert8.0软件对表4中的数据进行2次多元回归拟合，得到乙醇体积分数、料液比和提取时间与靛玉红提取量之间的2次多项回归方程，回归方程为Y＝4.51＋0.46X1＋0.63X2＋0.18X3－0.07X1X2＋0.12X1X3＋0.12X2X3－0.2X12－0.29X22－0.25X32，回归方程系数r＝0.，说明模型能解释96.44%响应值的变化，表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准确的预测实际情况。其校正决定系数radj为0.，表明此模型能解释93.11%效应值变化，因此该模型拟合程度良好。
对上述回归模型进行显著性检验，结果见表5。表5回归方程显著性检验P＜0.，1次项、2次项中乙醇体积分数、料液比和提取时间对大青叶提取液中靛玉红提取量的曲面效应差异显著（P＜0.、0.01、0.05）；3个因素的两两交互项对靛玉红提取量的曲面效应作用不显著（P＞0.05）。
2.4.3响应面分析及 提取条件的确定依据回归方程，在保持1个因素编码值为0时，借助Design-Expert8.0软件绘制其他2个因素与响应值关系的三维响应面图，结果见图2。由图2可以看出乙醇体积分数、料液比和提取时间3个因素中任意2个因素之间对靛玉红提取量的提取影响均较为显著，且响应曲面陡峭。为确定这3个影响因素的 取值，通过Design-Expert8.0软件分析，得出回归模型存在 值点，X1、X2、X3的代码值分别为1、1、?1，与之对应的实测值乙醇体积分数为62%、液料比为26、提取时间为9min，此时大青叶提取液中靛玉红提取量的 估计值为4.37mg/g。
2.5模型验证
为了验证此提取模型方程的适用性，在乙醇体积分数、液料比、提取时间 的水平上，重复试验3次，测定值为4.27、4.34、4.35mg/g，提取物总量为4.32mg/g（RSD为1.01%），与预测值4.37mg/g吻合极好，这说明响应面设计优化靛玉红提取 条件准确可靠[15]。
3讨论
Plackett-Burman设计联用CCD-RSM在实验设计精度上优于正交实验设计，为其应用于中药提取工艺优化的可行性提供了依据[16]。Plackett-Burman设计和星点设计的结合，充分发挥了各自的优点。
本实验采用Plackett-Burman设计联用CCD并通过RSM分析乙醇体积分数、液料比和提取时间3个因素对大青叶提取液中靛玉红含量的影响，优化得到的 提取工艺：乙醇体积分数为62%，液料比为26，提取时间为9min。验证实验表明此方程具有可预测性。
参考文献（略）
来源：滕毅，杨海玲.Plackett-Burman设计联用星点设计-响应面法优选大青叶中靛玉红的提取工艺[J].中草药,,50(8):-.
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